Rabu, 30 November 2011

II. Isolasi dan Identifikasi Morfologi Koloni Bakteri, Jamur, Trichoderma, Actinomycetes dan Blue Green Algae serta Pengecatan Bakteri


A.    Pendahuluan
1.      Latar Belakang
Mikrobia merupakan jasad hidup yang sangat kecil ukurannya dan dapat dijumpai di berbagai tempat, baik di dalam tanah, air maupun udara dan dalam keadaan panas ataupun dingin seperti bakteri, cendawan, Actinomycetes, protozoa maupun organisme lain. Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, kita harus menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang di dalamnya hanya terdapat baktri tersebut tanpa adanya kontaminasi mikroba lain (biakan murni).
Selain teknik pertumbuhan bakteri dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diinginkan. Selain itu, dilakukan pengecatan bakteri untuk mengetahui jenis  bakteri dari sifat pengecatannya.
2.      Tujuan Praktikum
Praktikum Mikrobiologi Pertanian ini bertujuan agar :
a.          Mahasiswa mampu mengisolasi bakteri, jamur, Trichoderma, Actinomycetes dan Blue Green Algae.
b.         Mahasiswa mampu membedakan bakteri, jamur, Trichoderma, Actinomycetes dan Blue Green Algae.
c.          Mahasiswa dapat melakukan pengecetan bakteri dan mengetahui jenis bakteri berdasarkan sifat pengecetan.
3.      Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Mikrobiologi Pertanian ini dilaksanakan pada tanggal 2 November 2010, bertempat di Laboratorium Biologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret.
B.     Tinjauan Pustaka
Populasi kelompok mikrobia sama besar kompleks bentuk serta sifatnya. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai jenis habitat menentukan teknik memisahkan populasi campuran atau biakan campuran menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni berisi populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Chan, et al.,1992).
Isolasi mikrobia pada prinsipnya adalah memisahkan suatu jenis mikrobia dengan jenis mikrobia lainnya dengan asal mikrobia yang terdiri dari berbagai macam spesies. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada media padat. Pada media padat ini sel-sel akan membentuk suatu koloni sel yang tetap. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media pada beberapa tempat yang terpisah maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (Schlegel,1994).
Beratus-ratus spesies mikroba dapat menghuni berbagai macam bagian tubuh kita, seperti mulut, saluran pencernaan dan lain-lain. Satu gram kotoran manusia atau hewan dapat mengandung jutaan bakteri. Populasi mikroorganisme tersebut pada umumnya terdapat dalam populasi campuran. Untuk mengidentifikasikan suatu spesies tertentu, pertama harus dilakukan adalah memisahkannya dari organisme lain, hingga diperoleh biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan satu sel tunggal (Palezar, 1986).
Pewarnaan bakteri ada dua macam yaitu pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram digunakan untuk mengetahui sifat bakteri yang bersifat asam dan basa. Bakteri gram positif akan memberi warna ungu, sedangkan bakteri yang bersifat negatif akan memberikan warna merah. Pada pewarnaan tahan asam digunakan untuk mengetahui jenis bakteri yang diamati, bakteri yang tahan asam akan memberikan warna merah sedang yang tidak tahan asam memberikan warna biru (Anonim, 2009).
C.    Alat, Bahan dan Cara Kerja
1.      Alat
a.       Isolasi dan Identifikasi Morfologi Koloni Mikrobia
1)      Lampu Bunsen
2)      Kapas
3)      Jarum Ose
4)      Dry glaski
5)      Tabung reaksi
6)      Pipet
7)      Erlenmeyer
8)      Inkubator
9)      Cawan petri
10)  Kertas label
11)  Hand Colony Counter
12)  Spidol
13)  Jarum inokulasi
b.      Pengecatan Bakteri
1)      Kapas
2)      Jarum ose
3)      Kaca Preparat
4)      Pipet
5)      Lampu bunsen
2.      Bahan
a.       Isolasi dan Identifikasi Morfologi Koloni Mikrobia
1)      Tanah Vertisol
2)      Sampel air (diduga terdapat koloni Cyanobakteria)
3)      Alkohol
4)      Media NA dan CHU
5)      Media agar miring (NA dan PDA)
6)      Media soluble-casein (cair dan agar)
7)      Media TSM (Tricoderma Specific Media)
8)      Aquades
9)      Garam fisiologis
b.      Pengecatan Bakteri
1)      Koloni bakteri
2)      Alkohol
3)      Aquades
4)      Kristal violet
5)      Larutan iodium
6)      Alkohol 95 %
7)      Safranin
3.      Cara Kerja
a.       Isolasi dan Identifikasi Morfologi Koloni Mikrobia
1)      Bakteri dan Fungi (umum)
a)      Memasukkan 10 g bahan ke dalam 90 ml garam fisiologis, lalu digojog hingga homogen (pengenceran 10-1)
b)      Mengambil 1 ml larutan 10-1, memasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis, lalu digojog hingga homogen (pengenceran 10-2)
c)      Melalukan hal yang sama hingga pengenceran 10-5
d)     Mengisolasi mikrobia ke dalam media NA dan PDA dengan cara berikut :
·         Mengambil 0,1 ml larutan 10-2 dan menuangkan ke dalam media PDA da NA, lalu meratakan larutan tersebut ke seluruh media dengan dryglassky steril
·         Melakukan hal yang sama terhadap semua pengenceran
e)      Menginkubasi isolat-isolat tersebut pada suhu kamar dengan posisi petridis terbalik selama 2 hari, kemudian mengamati jumlah koloni dari mikrobia yang tumbuh
f)       Menghitung jumlah koloni yang tumbuh menggunakan hand colony counter
2)      Fungi Tricoderma
a)      Membuat biakan murni terkebih dahulu dengan mengambil cuplikan koloni jamur yang tumbuh pada poin a (jamur umum, media PDA) dengan jarum ose kemudian menginokulaskan pada media agar miring secara zig-zag, kemudian inkubasi selama 2 hari
b)      Setelah koloni tumbuh, mengambil sebagian dan menginokulasikan lagi pada TSM dengan metode goresan T (3 kuadran), inkubasi 2 hari dan mengamati morfologi koloninya.
3)      Bakteri Actinomycetes
a)      Membuat biakan murni terkebih dahulu dengan mengambil cuplikan koloni jamur yang tumbuh pada poin a (bakteri umum, media NA) dengan jarum ose kemudian menginokulaskan pada media agar miring secara zig-zag, kemudian inkubasi selama 2 hari.
b)      Setelah koloni tumbuh, mengambil sebagian dan menginokulasikan lagi ke dalam tabung berisi 5 ml media soluble-casein cair steril (inokulan dishaker selama 2 hari).
c)      Inokulan diambil sebanyak 0,2 ml dan diinokulaskan ke dalam media soluble-casein agar dengan metode cawan sebar (perataan dengan dryglassky).
d)     Menginkubasi pada suhu 30 ˚C selama 2 hari atau lebih sampai koloni Actinomycetes tumbuh.
e)      Setelah tumbuh, mengamati morfologi koloni yang terbentuk.
4)      Blue Green Algae/Cyanobacter
a)      Melakukan teknik pengenceran bertingkat seperti poin a, tetapi menggunakan bahan berupa sampel air yang diduga terdapat koloni Cyanobakter (10 g sampel tanah diganti dengan 10 ml sampel air).
b)      Mengisolasi pada media NA dan inkubasi selama 2 hari.
c)      Mengamati morfologi koloninya.
b.      Pengecatan Bakteri
1)      Membersihkan kaca preparat dengan alkohol 95 %.
2)      Membuat goresan pada bakteri dari media NA.
3)      Memfiksasi pada nyala api selama 1 detik, sambil digerakkan.
4)      Mewarnai goresan bakteri dengan gram a lalu memfiksasi 1 detik dan mendiamkannya selama 1 menit.
5)      Memiringkan kaca preparat dan menyemprot dengan aquades kemudian biarkan kering.
6)      Mewarnai goresan bakteri dengan gram b lalu memfiksasi 1 detik dan mendiamkannya selama 2 menit.
7)      Memiringkan kaca preparat dan menyemprot dengan aquades kemudian biarkan kering.
8)      Mencuci dengan etanol 95 % (gram c) sampai warna ungu tidak mengalir.
9)      Mewarnai goresan bakteri dengan gram d lalu memfiksasi 1 detik dan mendiamkannya selama 30 detik.
10)  Memiringkan kaca preparat dan menyemprot dengan aquades kemudian biarkan kering.
11)  Mengamati bakteri pada mikroskop.
12)  Menentukan sifat bakteri berdasarkan sifat pengecatan.









D.    Hasil Pengamatan dan Pembahasan
1.      Hasil Pengamatan
Tabel 2.1 Hasil Pengamatan pada Tanah Alfisol
No
Media
Pengenceran
Ulangan
Gambar
Hasil Pengamatan
1
NA
10-4
1
NA 10 4.jpg
B : Filament
E : Datar
T : Lekukan
W: Putih tulang
P :Berkontur
O : Translucent
2
NA
10-5
1
NA 10 5.jpg
B : Sirkular
E : Timbul
T : Berlekuk
W: Kuning
P :Berkontur
O : Buram
3
CHU
10-4
1
Image(490).jpg
B : -
E : Datar
T : -
W: Coklat
P : -
O : Buram
(terkontaminasi)
4
CHU
10-4
2
Image(491).jpg
B : -
E : -
T : -
W: Putih tulang
P : Coklat
O : Buram
(terkontaminasi)
5
CHU
10-4
3
Image(492).jpg
B : Bundar
E : Datar
T : -
W: Coklat
P : -
O : -
6
CHU
(media rusak)
10-5
1
Image(493).jpg
B : -
E : Timbul
T : -
W: Coklat
P : -
O : -
7
CHU
10-5
2
Image(494).jpg
B : -
E : Datar
T : -
W: Coklat
P : -
O : -
8
CHU
10-5
3
Image(495).jpg
B : Bundar
E : Datar
T : Berombak
W: Coklat
P : Licin
O : Buram
Sumber : Laporan Sementara
Keterangan : B : Bentuk, E : Elevasi,  T : Tepian, W : Warna, P : Permukaan, O : Opacity
Tabel 2.2 Hasil Pengamatan Pengecatan Bakteri
Kelompok
Pengenceran
Jenis Tanah
Warna
Gram
19-20
10-4
10-5
Vertisol (NA)
Vertisol (NA)
Ungu
Ungu
(+) positif
(+) positif
21-22
10-4
10-5
Alfisol (NA)
Alfisol (NA)
Merah
Merah
(-) negatif
(-) negatif
23-24
10-4
10-5
Vertisol (AIA)
Vertisol (AIA)
Merah
Merah
(-) negatif
(-) negatif
Sumber : Laporan Sementara
2.      Pembahasan
Isolasi merupakan usaha untuk mengasingkan suatu mikrobia tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh biakan murni atau kultur murni. Dalam melakukan isolasi salah satu hal yang perlu diperhatikan adalah kesterilan dari alat dan media yang digunakan. Isolasi dilakukan dengan cara isolasi pada agar cawan, isolasi pada medium cair dan isolasi sel tunggal.
Kultur atau biakan murni adalah kultur yang sel-sel mikrobianya berasal dari hasil pembelahan sel tunggal. Isolasi bakteri dan blue green algae menggunakan media NA, isolasi jamur menggunakan media PDA, dan isolasi trichoderma menggunakan media TSM, CHU untuk Cyanobakter dan AIA untuk Actinomycetes. Komposisi NA adalah beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 15 g, aquades 1000 ml dan NaCl 5 g. Komposisi PDA adalah kentang 3 g, peptone 5 g, agar 15 g dan Aquades 1000 ml.  Komposisi AIA antara lain 1 g soluble starch; 0,03 g casein; 0,2 g KNO3; 0,2 g K2HPO4; 0,005 g MgSO4.7H2O; 0,002 g CaCO3 dan 0,001 g FeSO4.7H2O.  Komposisi CHU adalah K3HPO4 0,005%-0,1%; C2(NO3)2 0,004%; MgSO4.7H2O 0,0025%; NaCO3 0,002%; NaSiO3 0,0025%; FeCl3 0.0025% dan FeCl3 0,0008%. Sedangkan komposisi TSM adalah MgSO4.7H2O 0,15 g; K2HPO4 0,68 g; KCl 0,12 g; NH4NO3 0,75 g; agar 15 g; glukosa anhydrous (D+) 2,25 g dan rosebenga 0,12 g.  Hal-hal yang diamati dalam isolasi ini adalah bentuk, elevasi, tepian, warna, permukaan, dan opacity (transparansi). Dalam perlakuan isolasi tanah dilakukan pengenceran sehingga konsentrasi menjadi 10-1 dan 10-5 yang bertujuan untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup. Selain itu, metode ini dipakai untuk kuantifikasi tidak langsung. Pada pengenceran 10-1 jumlah mikrobia lebih banyak dari pengenceran 10-5.Hal ini dikarenakan semakin encer larutan tanah dan tanaman, semakin sedikit mikrobia yang ada.
Suatu mikrobia setelah mengalami isolasi selanjutnya ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni adalah biakan sel-sel yang berasal dari pembelahan satu sel tunggal. Diperlukan akan adanya biakan murni dikarenakan semua metode mikrobiologis, biakan murni digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikrobia, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, maupun fisiologis. Memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikrobia saja. Prinsip diadakan biakan murni adalah mengencerkan organisme sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya., dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang tampak pada petridish setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal         (Wedhastri, 2002).
Pada praktikum ini, dilakukan isolasi dengan media CHU dan NA. Hampir semua media yang digunakan tidak begitu baik, hal itu juga yang mengakibatkan adanya kontaminan terutama jamur. Namun, selain karena media, kontaminan juga bisa terjadi karena pengaruh suhu, kelembaban ataupun dalam penutupan media yang kutang rapat sehingga memungkinkan masuknya kontamianan.
Pewarnaan bakteri dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri dari sifat pengecatan bakteri tersebut (gran negatif dan gran positif). Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:
a.       Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.
b.      Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
c.       Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama
d.      Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya
Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram positif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya. Jika berwarna merah berarti menunjukkan gram negatif, sedangkan warna ungu berarti menunjukkan gram positif.




















E.     Kesimpulan dan Saran
1.      Kesimpulan
Berdasarkan Praktikum Mikrobiologi Pertanian ini dapat diambil kesimpulan, antara lain :
a.       Isolasi merupakan usaha untuk mengasingkan suatu mikrobia tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh biakan murni atau kultur murni.
b.      Dalam melakukan isolasi perlu mensterilka alat-alat yang digunakan untuk menghindari adanya kontaminan.
c.       Isolasi bakteri dan isolasi blue green algae menggunakan media NA, isolasi jamur menggunakan media PDA, dan isolasi trichoderma menggunakan media TSM, CHU untuk Cyanobakter dan AIA untuk Actinomycetes.
d.      Hal-hal yang diamati dalam isolasi ini adalah bentuk, elevasi, tepian, warna, permukaan, dan opacity (transparansi).
e.       Pewarnaan bakteri dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri dari sifat pengecatan bakteri tersebut (gran negatif dan gran positif).
f.       Jika berwarna merah berarti menunjukkan gram negatif, sedangkan warna ungu berarti menunjukkan gram positif.
2.      Saran
a.       Pelaksanaan praktikum sebaiknya bisa tepat waktu.










Daftar Pustaka
Anonim. 2009. Pengantar Mikrobiologi,  http://www.wanna_share. 23s9887_apm.html. Diakses tanggal 8 Desember 2010.
Chan, et al,1992. . Mikrobiologi kedokteran. Surabaya, Airlangga University Press.
Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Schlegel, 1994. Dasar-Dasar Mikrobiolog. Jakarta, Universitas Indonesia Press
Wedhastri, Sri. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacter sp. Penghasil Faktor Tumbuh dan Penambat Nitrogen dari Tanah Masam. Jurnal Ilmu Tanah dan Lingkungan Vol III (1), Februari 2002, hal 45-51.